1. 將含有凍存細胞的安瓿放入 37℃ 水浴中解凍。

2. 用 70% 乙醇對安瓿的頂端進行消毒，打開安瓿，用吸管將細胞轉移到含有 5 ml 起始培養基的 25 cm2 組織培養瓶中，輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，將其放入 5% CO2 加濕培養箱中 37℃ 培養過夜。

3. 吸出起始培養基，換成適當的維持培養基。將細胞放回 CO2 培養箱 37℃ 培養，每天檢查細胞是否生長至匯片。

4. 如果細胞生長至匯片，吸出培養基。

5. 用 PBS 或胰酶/EDTA 清洗細胞，除去細胞上殘留的血清，將洗液吸出。

6. 用 37℃ 、適當體積的胰酶/EDTA 剛好覆蓋單層細胞（如對于 25 cm2 培養瓶需要 0.3 ml）。消化 30～40 s（細胞應該分開），晃動培養瓶使細胞*分開。

7. 加入 1.4 ml 適當的維持培養基，用吸管來回吹打細胞懸液多次以打散細胞團（這些細胞用于傳代）。

8. 吸出 0.5 mL 的細胞懸液，將其加入到新的含有 30 ml 維持培養基 150 cm2 的組織培養瓶中。輕輕搖動培養瓶，使細胞均勻分布于培養瓶中，將其放入 CO2 培養箱中 37℃ 培養直到細胞生長至匯片（大約 1 周）。大約間隔一周用維持培養基進行 1:20 稀釋傳代以維持細胞生長。