一、實驗材料準備
 

1.  實驗動物
 

每次實驗采用10只2-3周齡SD大鼠，雌雄均可，體重40~60 g。

2.  試劑
 

纖連蛋白(fibronectin)、Ⅳ型膠原、鼠尾膠、葡聚糖(dextran，分子量100~200 kDa)和DNA酶I(DNase I)購自Sigma公司；D-Hanks'液、10xPBS按配方自制；II型膠原酶購自Worthington公司；明膠、牛血清白蛋白(BSA)、HEPES購自Amresco公司；Percoll 購自Amersham Biosciences；DMEM(高糖)購自GIBCO/BRL公司；肝素鈉、NaHCO3購自中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司；青、鏈霉素購自上海生工生物工程有限公司；胎牛血清(FBS)購自PAA Laboratories；堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)，膠原酶/分散酶(collagenase/dispase)購自Roche公司。
 

3.   儀器
 

低溫離心機(Centrifuge 5810 R，購自Eppendorf；Himac CR 22F，購自Hitachi)。
 

4.  試劑配制
 

（1）1 mg/ml鼠尾膠(用0.2%乙酸配制)，1%明膠(用D-Hanks'液配制)，1%II型膠原酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%的濃度)，1%膠原酶/分散酶(用DMEM配制，用時稀釋成0.1%)，15%葡聚糖(用PBS配制)，20% BSA(用DMEM配制，調pH值至7.4后用0.45 um濾膜過濾除菌，較難過濾)，DNase I(用冷PBS配制成2 U/ul)，以上試劑經0.22 μm濾膜過濾除菌后分裝保存于-20℃。

（2）50%Percoll(配12 ml，需6 ml Percoll原液，0.67 ml 10xPBS，0.4 ml FBS，4.93 ml PBS)；DMEM培養液(含4000 mg/L D-葡萄糖，4 mmol/L L-谷氨酰胺，添加3.7 g/L NaHCO3，20 mmol/L HEPES，肝素鈉 100 mg/L，青霉素 100 U/ml，鏈霉素 100 ug/ml)，pH值調至7.4，過濾除菌后分裝保存于4 ℃，用時加入20% FBS及1 ng/ml bFGF。
 

二、培養皿預處理
 

1.  涂布3種不同的基質，培養前一天加入1 ml 1%明膠于35 mm塑料培養皿，置于37 ℃培養箱過夜，接種前用D-Hanks'液漂洗2次。

2.  接種前4 h，加入鼠尾膠6~10 ug/cm2，在密閉的器皿里用氨氣熏5~10 min后，置于室溫1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。

3.  50 ul 0.1%纖連蛋白、50 ul 1 mg/ml Ⅳ 型膠原和400 ul雙蒸水混合后，加入到每個培養皿中涂布均勻后吸出，可涂布10個培養皿，置于37 ℃培養箱1~2 h晾干后，用D-Hanks'液漂洗2次。
 

三、 腦微血管段的分離與腦微血管內皮細胞原代培養
 

1.  大鼠頸椎脫臼處死后浸泡于75%乙醇中消毒3~5 min后斷頭置于玻璃培養皿中，打開顱腔后取出全腦置于盛有冷D-Hanks'液的玻璃培養皿中解剖去除小腦、間腦(包括海馬)。

2.  隨后將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以吸除軟腦膜及腦膜大血管后置于新的含冷D-Hanks'液玻璃培養皿中，用細解剖鑷去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，保留大腦皮質。

3.  用D-Hanks'液漂洗3次后，加入1 ml DMEM培養液，用虹膜剪將其剪碎成1 mm3大小，加入0.1%Ⅱ型膠原酶(含30 U/ml DNase I，1 ml/大腦)混勻后37 ℃水浴消化1.5 h。

4.  離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入20% BSA懸浮混勻后離心(1000 g，20 min，4 ℃)或加入15%葡聚糖懸浮混勻后離心(4 000 rpm，20 min，4 ℃)，去除中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀。

5.  加入2 ml 0.1%膠原酶/分散酶(含20 U/ml DNase I)懸浮混勻后37 ℃水浴消化1 h，離心(1 000 rpm，8 min，室溫)，去上清液，加入2 ml DMEM培養液懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的12 ml 50% Percoll(25 000 g，60 min，4 ℃)。

6.  離心(1 000 g，10 min，4 ℃)，靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后用DMEM漂洗兩次(離心1 000 rpm，5 min，室溫)，去上清液。

7.  加入DMEM*培養液(含20% FBS，100 μg/ml肝素鈉)懸浮后接種于涂布基質的35 mm一次性塑料培養皿(1.5 ml/培養皿，可接種1個培養皿/大腦)，置于37 ℃、5%CO2培養箱內靜置培養，12~24 h后換液，并加入1 ng/ml bFGF，隨后隔天換液。

 

四、鑒定方法
 

形態學、Ⅷ因子相關抗原免疫組織化學檢測。
 

五、 結果
 

1.   細胞形態觀察
 

接種當時可見由圓形的內皮細胞構成的呈單枝狀或分枝狀的腦微血管段，并可見散在的單細胞及組織碎片(見圖1-1)；培養12~24 h后可見培養的細胞從貼壁的微血管段周圍長出，細胞呈短梭形，區域性單層生長，經換液后微血管段的殘余部分不斷減少，成纖維細胞、周細胞等雜細胞含量較少；隨著培養時間的延長，內皮細胞不斷增殖，可見"漩渦"分布，大約5~7天細胞達到融合，短梭形的內皮細胞占90%以上，但可見少量周細胞等雜細胞生長于內皮細胞單層表面或細胞克隆間隙(結果未顯示)。細胞生長過程見圖1，細胞接種于纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿。


 

2.   涂布不同基質的細胞生長情況
 

明膠及鼠尾膠涂布的培養皿微血管段貼壁時間較長，6 h時可見少量微血管段貼壁但無內皮細胞長出，12~24 h可見一些內皮細胞長出，24 h后腦微血管段*貼壁并有較多的內皮細胞長出，兩者無明顯差異(見圖2-1~4)；纖連蛋白/Ⅳ型膠原涂布的培養皿培養后6 h即可見微血管段貼壁并有一些內皮細胞長出，12~24 h內基本*貼壁并有較多的內皮細胞長出(見圖2-5,6)。


 

3.  免疫組化鑒定
 

Ⅷ因子相關抗原免疫組化檢測可見培養的腦微血管內皮細胞的胞漿及核周有棕黃色著色，胞核呈空泡狀結構；對照染色為陰性。