步驟

一、小鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)步驟

1.  于無(wú)菌條件下切取鼠頭并以75%酒精浸泡1 min，解剖出完整鼠腦。

2.  預(yù)冷解剖液中分離去除軟膜、血管、取大腦皮質(zhì)漂洗，用眼科剪將皮質(zhì)反復(fù)剪切成碎塊。

3.  移入培養(yǎng)皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2 ml，37℃培養(yǎng)箱中消化30 min。

4.  將皮層組織碎塊移入離心管，棄去剩余消化液，用接種液洗3次，每次洗滌后使組織塊充分沉降到試管底，棄去上清液。

5.  最后再用接種液1 ml混懸，反復(fù)吹打（巴氏吸管）混懸液中組織塊，力度適中，至渾濁后將上清液移入培養(yǎng)瓶待用。

6.  加入1ml接種液后再次吹打，如此反復(fù)3-4次，組織塊逐漸消化后，棄去最終殘塊。

7.  收集含單細(xì)胞懸液的上清液約4-5 ml于培養(yǎng)瓶中，以接種液重新懸浮細(xì)胞，細(xì)胞記數(shù)；接種1x107個(gè)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中。

8.  培養(yǎng)24 h至細(xì)胞貼壁后，換全培養(yǎng)液（DMEM/F12+2%B27）培養(yǎng)3d，觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)狀況。

9.  換用阿糖胞苷培養(yǎng)液、  每隔3d換全培養(yǎng)液1次，每次換半液。

二、神經(jīng)元免疫化學(xué)鑒定

1.  4%多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，PBS洗滌3次。

2.  加入無(wú)水甲醇:30%雙氧水（5:1）處理30 min，PBS洗滌3次。

3.  加入5%羊血清封閉20 min，棄去多余液體。

4.  加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神經(jīng)元特異性烯醇化酶），培養(yǎng)箱中孵育2-4 h，PBS洗滌3次。

6.  加入DAPI染液（1:40），室溫放置5-10 min；PBS洗滌3次。

7.  熒光顯微鏡觀察。 

三、結(jié)果      

圖1： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖

圖2： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)1d后

圖3： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)2d后

圖4： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)3d后

圖5： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)4d后

圖6： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)5d后

圖7： 剛接種時(shí)細(xì)胞圖培養(yǎng)6d后

圖8：第7d免疫鑒定圖