本期分享第三期的細胞培養(yǎng)常見問題的內容，希望對大家有所幫助啦~

20. 如果細胞發(fā)生微生物污染時，應如何處理？

原則上：直接滅菌后丟棄之。

當重要的培養(yǎng)污染時，研究者可能試圖消除或控制污染。首先，確定污染物是細菌、真菌、支原體或酵母，把污染細胞與其它細胞系隔離開，用實驗室消毒劑消毒培養(yǎng)器皿和超凈臺，檢查HEPA過濾器。

高濃度的抗生素和抗霉菌素可能對一些細胞系有毒性，因而，做劑量反應實驗確定抗生素和抗霉菌素產生毒性的劑量水平。這點在使用抗生素如兩性霉素B和抗霉菌素如泰樂菌素時尤其重要。下面是推薦的確定毒性水平和消除培養(yǎng)污染的實驗步驟。

(1)  在無抗生素的培養(yǎng)基中消化、計數(shù)和稀釋細胞，稀釋到常規(guī)細胞傳代的濃度。

(2)  分散細胞懸液到多孔培養(yǎng)板中，或幾個小培養(yǎng)瓶中。在一個濃度梯度范圍內，把選擇抗生素加入到每一個孔中。例如，兩性霉素B推薦下列濃度，0.25，0.50，1.0，2.0，4.0，8.0 mg/ml。

(3)  每天觀測細胞毒性指標，如脫落，出現(xiàn)空泡，匯合度下降和變圓。

(4)  確定抗生素毒性水平后，使用低于毒性濃度2～3倍濃度的抗生素的培養(yǎng)液培養(yǎng)細胞2～3代。

(5)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞一代。

(6)  重復步驟4。

(7)  在無抗生素的培養(yǎng)基中培養(yǎng)4～6代，確定污染是否以已被消除。

21. 支原體(mycoplasma) 污染的細胞， 是否能以肉眼觀察出異狀？

不能。除極有經驗之專家外，大多數(shù)遭受支原體污染的細胞株，無法以其外觀分辨之。

22. 支原體污染會對細胞培養(yǎng)有何影響？

支原體污染幾乎可影響所有細胞的生長參數(shù)，代謝及研究的任一數(shù)據。故進行實驗前，必須確認細胞為mycoplasma-free，實驗結果的數(shù)據方有意義。

23. 偵測出細胞株有支原體污染時， 該如何處理？

直接滅菌后丟棄，以避免污染其它細胞株，但是如果您的樣本珍貴，建議您使用支原體去除試劑去除污染

24. CO2 培養(yǎng)箱的水盤如何保持清潔？

定期(至少每兩周一次) 以無菌蒸餾水或無菌去離子水更換之。

25. 為何培養(yǎng)基保存于4℃ 冰箱中， 顏色會偏暗紅色，且pH值會越來越偏堿性？

培養(yǎng)基保存于4℃冰箱中，培養(yǎng)基內的CO2會逐漸溢出，造成培養(yǎng)基越來越偏堿性。而培養(yǎng)基中的酸堿指示劑(通常為phenol red) 的顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。培養(yǎng)基偏堿的結果，將造成細胞生長停滯或死亡。若培養(yǎng)基偏堿時，可以通入無菌過濾的CO2，以調整pH 值。

26. 各種細胞培養(yǎng)用的dish，flask是否均相同？

不同廠牌的dish 或flask，其所coating 的polymer 不同，制造程序亦不同，雖對大部分細胞沒有太大之影響，惟少數(shù)細胞則可能因使用廠牌不同的dish 或flask 而有顯著的生長差異。

27. 購買的細胞冷凍管經解凍后，為何會發(fā)生細胞數(shù)目太少的情形？

研究人員在冷凍細胞的培養(yǎng)時出現(xiàn)細胞數(shù)目太少，大都是因為離心過程操作上的失誤，造成細胞的物理性損傷，以及細胞流失。建議細胞解凍后不要立刻離心，應待細胞生長隔夜后再更換培養(yǎng)基即可。

28. 購買的細胞死亡或細胞存活率不佳可能原因？

研究人員在細胞培養(yǎng)時出現(xiàn)存活率不佳，常見原因可歸納為：培養(yǎng)基使用錯誤或培養(yǎng)基品質不佳。血清使用錯誤或血清的品質不佳。解凍過程錯誤。冷凍細胞解凍后，加以洗滌細胞和離心。懸浮細胞誤認為死細胞。培養(yǎng)溫度使用錯誤。細胞置于-80℃太久。

29. 如何避免沉淀物的產生?

我們建議您在使用血清的時候，注意下列的操作:

(1)  解凍血清時，請按照所建議的逐步解凍法(-20℃至4℃至室溫)，若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)，非常容易產生沉淀物。

(2)  解凍血清時，請隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉淀的發(fā)生。

(3)  請勿將血清置于37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩(wěn)定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。

(4)  血清的熱滅活非常容易造成沉淀物的增多，若非必要，可以無須做此步驟。

(5)  若必須做血清的熱滅活，請遵守56℃，30分鐘的原則，并且隨時搖晃均勻。溫度過高，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉淀物的增多。

30.  L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)中重要嗎？它在溶液中不穩(wěn)定嗎？

L-谷氨酰胺在細胞培養(yǎng)時是重要的。脫掉氨基后，L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細胞的能量來源、參與蛋白質的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經過一段時間后會降解，但是確切的降解率一直沒有最終定論。L-谷氨酰胺的降解導致氨的形成，而氨對于一些細胞具有毒性。

31.  GlutaMAX-I是什么？培養(yǎng)細胞如何利用GlutaMAX-I？這個二肽有多穩(wěn)定？

GlutaMAX-I 二肽是一個L-谷氨酰胺的衍生物，其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來保護。一種肽酶逐漸裂解二肽，釋放L-谷氨酰胺供利用。

GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定，即使在121℃滅菌20分鐘，GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解，如果在相同條件下，L-谷氨酰胺幾乎*降解。

32. 什么培養(yǎng)基中可以省去加酚紅？

酚紅在培養(yǎng)基中用作PH值的指示劑：中性時為紅色，酸性時為黃色，堿性時為紫色。研究表明，酚紅可以模擬固醇類激素的作用，（特別是雌激素）。為避免固醇類反應，培養(yǎng)細胞，尤其是哺乳類細胞時，不用加。

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