步驟

一、ARVM 細(xì)胞分離的準(zhǔn)備工作

1. 準(zhǔn)備如下設(shè)備及器材：

對(duì)流工作臺(tái)或?qū)恿魇匠瑑襞_(tái)

乙酉迷罩 

冷凝器

循環(huán)水浴和水浴搖床

帶夾的圈型架

免蠕動(dòng)泵

臺(tái)式醫(yī)用離心機(jī)

95% O2 5% CO2 混合氣體

400 ml 無(wú)菌燒杯

ColorpHast pH 試紙（精密型）

2. 在對(duì)流式或?qū)恿魇焦ぷ髋_(tái)中，裝配 Langedorff 系統(tǒng)，把冷凝器和三通管夾著固定在圈型架上，管子接上蠕動(dòng)泵。冷凝器連接 37℃ 循環(huán)水浴，這樣溫水從冷凝器底部流進(jìn)從頂部流回水浴。

3. 在工作臺(tái)的無(wú)菌區(qū)域，布置下列無(wú)菌器械，這些可以是高壓滅菌過(guò)的或一次性無(wú)菌器材：

組織鉗

大號(hào)剪刀

彎頭小夾子 2 個(gè)

小剪刀

蚊式止血鉗

Swinnex 25 mm 規(guī)格的濾器支架

250 ml 燒杯

玻璃管和硅膠管

帶螺蓋的，50 ml 錐形瓶，內(nèi)加小攪拌棒

帶螺蓋的 250 ml 錐形瓶

一次性培養(yǎng)皿，吸管，60 ml 注射器，15 ml 和 50 ml 離心管，縫合線

4. 準(zhǔn)備加 CaCl2 和不加 CaCl2 的 Krehs-Henseleit（KH）培養(yǎng)基，過(guò)濾除菌 37℃ 保溫。

5. 充氧飽和 KH 緩沖液和無(wú)鈣 KH 培養(yǎng)基直到 pH 值約 7.4。轉(zhuǎn)移 150 ml 氧飽和的無(wú)鈣 KH 緩沖液至無(wú)菌的 250 ml 帶螺帽錐形瓶中并置于 37℃ 水浴。螺帽務(wù)必蓋好。

6. 制備酶溶液Ⅰ。裝有氧飽和的無(wú)鈣 KH 緩沖液的錐形瓶中加 75 mg 的膠原酶和 45 mg 的透明質(zhì)酸酶。

7. 制備酶溶液Ⅱ。取 21 ml 溶液Ⅰ轉(zhuǎn)移至一支新管中，加 2 ml 胰酶和 20 μl 無(wú)菌 1 mol/L CaCl2 過(guò)濾除菌。膠原酶/透明質(zhì)酸酶溶液移至一無(wú)菌的 250 ml 的帶螺帽錐形瓶中，膠原酶/透明質(zhì)酸酶/胰酶液移至一無(wú)菌的 50 ml 帶螺帽錐形瓶中。

8. 往第一個(gè) 250 ml 燒杯中加 150 ml KH 緩沖液，并加入灌注系統(tǒng)，避免產(chǎn)生氣泡。在插管處檢查流過(guò)液的 pH 值，通以 95% O2/5%CO2 氣體將 pH 值調(diào)回 7.4。流出液體回收到無(wú)菌 400 ml 燒杯中。

9. 用預(yù)溫的 KH 緩沖液覆蓋整個(gè)平皿底。

10. 把第一只鼠放進(jìn)乙酉迷罩 中麻醉。

11. 把充過(guò)氧的無(wú)鈣 KH 緩沖液放進(jìn)第二只 250 ml 無(wú)菌燒杯中，將流速調(diào)高至 5.5 ml/min，灌注 6 分鐘。

12. 酶溶液Ⅰ放進(jìn)第三只 250 ml 燒杯中，泵速度調(diào)節(jié)至 8 ml/min，灌注 5 分鐘。把該 250 ml 燒杯放在心臟下面繼續(xù)重新灌注心臟 15 分鐘以上。

二、解剖動(dòng)物和灌注心臟

1. 動(dòng)物被麻醉后，放在 Langendorff 裝置的附近。動(dòng)物平躺放置，用乙醇浸潤(rùn)胸部剪開(kāi)胸部皮毛。

2. 用大剪刀在肋骨下切一橫向切口打開(kāi)胸腔，然后切開(kāi)胸膈膜。

3. 提起劍突，胸中線兩邊約 2 cm 處沿肋骨各做一條徑向切口，千萬(wàn)不要觸及心臟。

4. 用夾子掂起心臟，剪斷下方的連接，摘下心臟和胸腺，摘下的心臟放在裝有 KH 溶液的佩特里氏平皿，然后轉(zhuǎn)到支著灌注設(shè)備的工作臺(tái)上。

5. 把心臟移到平皿的邊緣，提起胸腺露出主動(dòng)脈，用小剪刀剪掉胸腺。

6. 打開(kāi)泵，流速調(diào)至約每秒一滴。雙手穩(wěn)握兩把小鉗子，使主動(dòng)脈沿插套滑動(dòng)至插套管底部位于心臟的頂部。

7. 用蚊式止血鉗固定住心臟，鉗子夾著主動(dòng)脈底部并保證止血鉗夾著主動(dòng)脈上端。

8. 在止血鉗下部，用縫合線牢固地綁住心臟，灌注 3~5 分鐘使心臟血全部排出。

9. 從心臟上剔除殘余組織，保持肺動(dòng)脈以及動(dòng)脈附屬件的完整性。

三、心臟組織的消化

1. 酶溶液Ⅰ進(jìn)行灌注的最后 2 分鐘時(shí)，用 colorp Hast 試紙檢查液體的 pH 值，若有必要，通氣調(diào)節(jié) pH 至 7.4。

2. 從插套管上割下心室并仔細(xì)切成 1 mm2 的小塊。轉(zhuǎn)入裝有酶溶液Ⅱ 的 50 ml 錐形瓶中，于 37℃ 水浴，100 r/min 搖動(dòng)孵育 15 分鐘。

3. 用 5 ml 吸管稍微吹打上述樣品后轉(zhuǎn)入一支 50 ml 錐形離心管中加 20 ml 洗滌培養(yǎng)基。

4. 一支 60 ml 注射器，拿掉推桿，裝上 Swinnex 濾器。往針筒內(nèi)加入細(xì)胞懸液，把細(xì)胞過(guò)濾到一支新管中。

5. 500 r/min（50 g）離心 30 秒，去上清后，細(xì)胞重新溶于 10 ml 新的洗滌培養(yǎng)基中。

6. 讓梭形細(xì)胞沉降 20 分鐘，小心去上清，用 10 ml 新洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

7. 讓細(xì)胞沉降 15 分鐘，去上清，用 10 ml 洗滌培養(yǎng)基重懸細(xì)胞。

8. 重復(fù)上述洗滌步驟，共洗 4 次，最后一次洗滌后，倒去上清。加入 5 ml 洗滌培養(yǎng)基。

9. 重懸細(xì)胞后小心鋪放在 DMEM 配制的 6% BSA溶液上層，讓梭形細(xì)胞沉降 10~15 分鐘。

10. 最后的細(xì)胞團(tuán)應(yīng)包含高比例的活的梭形心室心臟細(xì)胞。每只心臟若能收到 3X106 個(gè)細(xì)胞就很不錯(cuò)了。

四、ARVM 細(xì)胞的培養(yǎng)

1. 在上述細(xì)胞洗滌的同時(shí)，準(zhǔn)備包被平板/蓋玻片/載玻片于室溫，用 10 μg/ml 層黏素溶液浸沒(méi) 30 分鐘。

2. 加入適量的培養(yǎng)皿重懸最后所得的細(xì)胞團(tuán)，并以每只 100 mm 規(guī)格平皿 1X106 個(gè)細(xì)胞的量接種至已包被過(guò)的平板上。

3. 讓細(xì)胞貼壁 1 小時(shí)，然后換新的培養(yǎng)基連續(xù)孵育。用加血清或不加血清的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng) 1 或 2 周。

4. 細(xì)胞隔天換液。

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