CRISPR慢病毒轉(zhuǎn)染法是一種高效引入CRISPR基因編輯系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞中的技術(shù)，旨在實(shí)現(xiàn)對(duì)基因的有針對(duì)性編輯或調(diào)控。

實(shí)驗(yàn)步驟：

1.質(zhì)粒構(gòu)建：構(gòu)建好含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒，其中包括lentiCRISPR-sgRNA。該質(zhì)粒攜帶

sgRNA序列，可指導(dǎo)Cas9蛋白準(zhǔn)確識(shí)別并切割目標(biāo)。

2.慢病毒包裝質(zhì)粒：準(zhǔn)備慢病毒包裝質(zhì)粒，其中包括pCMV-VSV-G（攜帶包膜蛋白）和pCMV-dR8.2 dvpr（攜帶包裝蛋白）。這兩者協(xié)同作用，使得慢病毒能夠高效地傳遞CRISPR-Cas9系統(tǒng)到目標(biāo)細(xì)胞內(nèi)。

3.細(xì)胞培養(yǎng)：使用適宜的培養(yǎng)基培養(yǎng)目標(biāo)細(xì)胞，通常選擇293T細(xì)胞，以確保細(xì)胞處于最佳的生長(zhǎng)狀態(tài)。

4.轉(zhuǎn)染試劑準(zhǔn)備：在進(jìn)行轉(zhuǎn)染前，將培養(yǎng)基更換為適用于陽(yáng)離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的Opti-MEM減血清培養(yǎng)基。同時(shí)，準(zhǔn)備轉(zhuǎn)染試劑，包括Lipofectamine 3000、助轉(zhuǎn)劑P3000以及含有CRISPR-Cas9系統(tǒng)的質(zhì)粒。

5.轉(zhuǎn)染操作：將質(zhì)粒混合物與轉(zhuǎn)染試劑按照試劑盒的推薦比例進(jìn)行混合，隨后滴加到目標(biāo)細(xì)胞上，此過程中，確保混合物與細(xì)胞充分接觸，有利于轉(zhuǎn)染效率的提高。

6.培養(yǎng)條件：將細(xì)胞置于37°C、5%CO2的培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)一定的時(shí)間，通常在48小時(shí)內(nèi)。

7.收獲：收集細(xì)胞上清液，通過離心去除細(xì)胞殘?jiān)?/p>

8.濾膜過濾：使用0.22 μm孔徑的聚醚砜濾膜過濾細(xì)胞上清液，以去除殘留的細(xì)胞碎片和其他雜質(zhì)。

9.慢病毒收獲：得到的慢病毒上清液即為經(jīng)過純化和感染活性驗(yàn)證的慢病毒，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)中對(duì)目標(biāo)細(xì)胞進(jìn)行感染（若病毒感染效率低，可使用試劑盒進(jìn)行濃縮病毒）。

10.慢病毒感染：將目的細(xì)胞接種于 6孔板中，待細(xì)胞貼壁后進(jìn)行慢病毒感染，感染后48H，加入適量濃度的篩選藥物puromycin（具體濃度通過藥物篩選實(shí)驗(yàn)獲得），24h后換液去除死細(xì)胞，繼續(xù)傳代維持培養(yǎng)。

11.單克隆篩選：

①流式細(xì)胞術(shù)篩選：此法存在一些不足之處，其中包括重懸細(xì)胞后進(jìn)行流式篩選的過程。因?yàn)檫@種操作可能導(dǎo)致細(xì)胞經(jīng)歷多次振蕩，增加了細(xì)胞的脆弱性，細(xì)胞的生存狀況可能會(huì)受到不良影響，所以不太建議采用這種方式。

②無限稀釋法，將96個(gè)細(xì)胞稀釋至10ml培養(yǎng)基中，然后將其種植到96孔板中，確保每個(gè)孔內(nèi)只有一個(gè)細(xì)胞。完成種植后，建議在觀察過程中每次僅觀察十個(gè)孔，因?yàn)殚L(zhǎng)時(shí)間的外部觀察可能導(dǎo)致細(xì)胞受到應(yīng)激損傷，影響后續(xù)的細(xì)胞培養(yǎng)，甚至?xí)?dǎo)致部分細(xì)胞死亡。進(jìn)行單克隆細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，首先將細(xì)胞鋪在96孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞長(zhǎng)至80%的融合后進(jìn)行消化。隨后，將細(xì)胞傳到48孔板、24孔板、12孔板、6孔板、6cm皿中，以確保單克隆的純化。并非所有細(xì)胞都能成功生長(zhǎng)，因此在考慮實(shí)際情況時(shí)，一般需要大約一兩個(gè)月的時(shí)間才能獲得理想的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

以上就是本期的內(nèi)容，更多資訊，歡迎點(diǎn)擊安培生物網(wǎng)站鏈接了解更多技術(shù)與產(chǎn)品資訊。

安培生物致力成為推動(dòng)生命科學(xué)進(jìn)步值得信賴的合作者

深圳/湛江安培生物科技有限公司,是一家具有核心的技術(shù)實(shí)力、先進(jìn)的經(jīng)營(yíng)管理水平和完善的市場(chǎng)銷售體系的生物高科技企業(yè)。總部設(shè)在廣東，服務(wù)面向全國(guó)。安培生物集進(jìn)口試劑、實(shí)驗(yàn)室耗材銷售、技術(shù)服務(wù)與合約開發(fā)為一體的專業(yè)化高科技公司，旨在為生命科學(xué)的發(fā)展提供較好的產(chǎn)品與服務(wù)。本公司建立了涵蓋分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、信號(hào)傳導(dǎo)和神經(jīng)科學(xué)等領(lǐng)域的產(chǎn)品供應(yīng)線，在各個(gè)領(lǐng)域內(nèi)向用戶提供較高的水平和質(zhì)量穩(wěn)定的產(chǎn)品，安培生物致力于為廣大的科研機(jī)構(gòu)、高等院校等客戶提供各種產(chǎn)品、技術(shù)支持與服務(wù)。

可以在第一時(shí)間為用戶提供比較先進(jìn)的專業(yè)資訊和完備的產(chǎn)品和物流服務(wù)。 專業(yè)的技術(shù)力量使得我們能夠?yàn)閺V大用戶提供強(qiáng)大的技術(shù)支持，深厚的人脈資源使得我們?cè)谌珖?guó)主要城市擁有眾多的合作伙伴，安培生物非常榮幸能將世界上先進(jìn)的高科技產(chǎn)品推薦給國(guó)內(nèi)從事生物學(xué)領(lǐng)域科研的老師和同仁。作為專業(yè)性的產(chǎn)品供應(yīng)商，公司出資存?zhèn)淞舜罅楷F(xiàn)貨，配合優(yōu)秀的銷售隊(duì)伍以及專業(yè)的技術(shù)支持，隨時(shí)為客戶提供服務(wù)。