microRNA(miRNA)是一種長度約為19-25nt單鏈RNA，一般參與轉錄后調節基因表達。作為非編碼RNA（ncRNA），目前大量的研究顯示一些差異表達miRNA在眾多的疾病中扮演著重要的角色，而了解miRNA差異表達，熒光定量PCR是最基礎、應用最多的檢測和定量miRNA的方法。

由于miRNA的長度比較短，因此傳統的熒光定量并不適用，下面介紹的兩種方法的最根本的原理其實就是延長miRNA.因此在這里分享了關于miRNA進行qPCR的兩種方法和一些經驗總結：

一、提取細胞、血清或外泌體RNA

就目前而言，針對不同樣品TRIZOL法提取RNA是比較通用的提取RNA的試劑，但是也具有相應的提取試劑盒（血清RNA提取試劑盒），目前一般均使用的是TRIZOL法提取的total RNA進行后續實驗，但有文獻說明TRIZOL法可能會導致miRNA丟失，也可選擇miRNA提取試劑盒。

二、miRNA的qPCR

1.miRNA莖環法逆轉錄 + miRNA熒光定量PCR

原理：在逆轉錄過程中我們需要設計一個莖環引物與我們miRNA序列結合起到延長miRNA的作用。而莖環引物是一個長度約為45bp且能夠自身環化的引物。每一個miRNA都具有自己特異的莖環引物。這最重要的原因就是設計的莖環引物中包含一段與miRNA互補序列有關：莖環逆轉錄引物 =5’端的莖環序列+3’端的miRNA的特定互補序列。

①莖環引物的設計：

首先我們在miRBase數據庫中查詢到miRNA的成熟序列(5’-3’)，利用excel中的替換功能將序列中的U全部換成T，一般地通用的莖環引物序列如CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGC3’ 或者5’GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGAC3’，紅色部分的序列可形成自身環化。

另外，針對特定miRNA設計的莖環引物：只需要在通用莖環引物3’端加上miRNA的成熟序列中的U更換成T后的序列3’端開始數6-8個堿基（一般選擇6個）的反向互補序列加在莖環通用序列的3’端即可，這樣就得到某個miRNA的莖環引物。

以hsa-miR-30b-5p為例，其成熟序列為UGUAAACAUCCUACACUCAGCU，U全部換成T：TGTAAACATCCTACACTCAGCT；則其莖環引物為：5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′

②逆轉錄（RT）：去除基因組DNA + 逆轉錄（可使用miRNA專用的莖環法逆轉錄試劑盒）

1）去基因組DNA（2ul基因組去除試劑）；

2）RNA體積：根據提取RNA濃度來定+free-RNase H2O(to 10ul);

3)吹打混勻，42度反應2min；

4)逆轉錄：1ul莖環引物（stem-loop）+試劑盒中逆轉錄MIX（2ul+2ul）+free-RNase H2O（5ul）(to 20 ul)

5)一般來說，一次逆轉錄只能進行一個miRNA的單獨逆轉錄，但是根據實際情況而言，我們可以將miRNA+內參U6混合在一管中一同逆轉成cDNA。

根據以上試劑盒設計的加樣量，我嘗試過一管內混合逆轉錄內參+5個miRNA，其中主要的變化就是在第一步增大所加入RNA的量，在第二步加莖環引物時，我們可以將所加入的free-RNase H2O（5ul）替換成不同的莖環引物(5個)，這種方式在特異性的基礎上又比較高效的合成多個miRNA，雖然節省試劑，但是也存在弊端，例如我們加入Mix(包含酶或dNTP等)都是一定量的，加入過多的莖環引物合成最終的各種miRNA的cDNA產物可能存在濃度過低，混合不勻可能會影響后續的熒光定量。

③熒光定量（qPCR）

5′-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACAGCTGA-3′，則通用反向引物為：5′-AGTGCAGGGTCCGAGGTATT-3′

2)熒光定量：10ul體系（20ul體系減半）(SYBR染料法)：

5ulSYBR+1ulcDNA+2ulfree-RNase H2O+2ul正反引物（提前混合）

例如：RT-qPCR分析hsa-miR-30b-5p的差異表達水平，以U6為內參：

對照組+處理組：此時為了減小誤差bar的大小做4個復孔，以八聯管為例：

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