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    TRIzol提取細(xì)胞RNA的經(jīng)驗(yàn)分享

    發(fā)布時(shí)間: 2024-03-26  點(diǎn)擊次數(shù): 705次

    一、TRIzol法提取RNA的原理

    Trizol是一種廣泛適用于多種樣品總RNA提取的試劑,例如人、動(dòng)物、植物和細(xì)菌、血液等。一般提取的總RNA沒有DNA和蛋白質(zhì)污染,常用于RT-qPCR、mRNA純化等實(shí)驗(yàn)。


    廣譜型Trizol含有異硫氰酸胍/酚,具有裂解能力,可在短時(shí)間內(nèi)裂解細(xì)胞和組織樣本并有效抑制RNase酶活性從而保證RNA的完整性。其原理是Trizol中異硫氰酸胍、苯酚等不可逆地使蛋白質(zhì)和RNase變性。隨后進(jìn)行離心。在酸性條件下,總RNA保留在上層水相中,而大部分DNA和蛋白質(zhì)保留在中間相或下層有機(jī)相中。然后通過用異丙醇沉淀回收總RNA。


    在這個(gè)過程中,可利用吡咯碳酸二乙酯(DEPC)可滅活RNase酶,75%的酒精洗滌RNA沉淀,去除蛋白質(zhì),相關(guān)有機(jī)物的污染;最后用無核酶水溶解白色沉淀得到所需RNA。值得注意的是TRizol有毒,需在通風(fēng)櫥內(nèi)操作,做好自我防護(hù)!!


    二、實(shí)驗(yàn)步驟
    以細(xì)胞6孔板為例:

    通常情況下,6孔板一般種100萬/孔細(xì)胞左右,對于TRIZOL法而言,該細(xì)胞數(shù)目已經(jīng)足夠,但對于新手而言,該數(shù)目提取的RNA濃度可能較低,因此我一般做濃度梯度或者時(shí)間梯度實(shí)為了保證RNA足夠后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求,因此我會(huì)再6孔板里面鋪200萬/孔細(xì)胞或者用6cm的中皿鋪300萬細(xì)胞。
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    圖1. 六孔板(孔內(nèi)細(xì)胞經(jīng)過處理,渾濁程度不同)
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    圖2. 6cm培養(yǎng)皿

    (1)對于細(xì)胞鋪板:一般情況下我會(huì)收集10cm的皿4個(gè)或者5個(gè)T25培養(yǎng)瓶,一般情況下細(xì)胞生長較好可能會(huì)有3000-4000萬的細(xì)胞,多的有5000萬(懸浮細(xì)胞)。以懸浮細(xì)胞為例,漿細(xì)胞收集至15ml離心管后,離心去上清,再用1-2ml新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,通常會(huì)用1ml重懸。根據(jù)傳統(tǒng)的細(xì)胞計(jì)數(shù)板估計(jì)細(xì)胞數(shù)目:


    ①將計(jì)數(shù)板和蓋玻片擦干凈,通常用酒精噴洗幾次,將蓋玻片蓋在計(jì)數(shù)板上

    ②此時(shí)我們會(huì)對細(xì)胞重懸液進(jìn)行稀釋,一般稀釋10-20倍(20ul細(xì)胞懸液+180細(xì)胞培養(yǎng)基/20ul+380ul)

    ③計(jì)數(shù)板四個(gè)大方格細(xì)胞總數(shù),壓線細(xì)胞計(jì)左不計(jì)右,按照公式:細(xì)胞數(shù)/ml:4個(gè)大格子細(xì)胞總數(shù)/4 ×稀釋倍數(shù)
    例如:細(xì)胞重懸為2ml,稀釋20倍,鋪6孔板,每孔大約200萬個(gè)細(xì)胞則:四個(gè)大方格計(jì)數(shù)分別為36,38,39,48,則平均數(shù)為40.25,細(xì)胞數(shù)目為40.25×20×10^4即大約有805萬個(gè)細(xì)胞/ml。
    鋪6孔板大約需要1200萬個(gè)細(xì)胞/2ml,則將取樣誤差計(jì)算在內(nèi):1200/805≈1.5,最終取1.51ml=1510ul細(xì)胞加新鮮培養(yǎng)基至12.1ml,驗(yàn)證:(1.51×805)/12.1≈100萬細(xì)胞左右,每孔取2ml。

    (2)言歸正傳,目前使用RNA裂解液(TRIZOL)提取RNA:需要自備無核酶水(DEPC水),異丙醇,氯仿(目前一般用氯仿替代物),無水乙醇。主要注意事項(xiàng)是:保證無酶環(huán)境,在通風(fēng)櫥內(nèi)操作!
    1)貼壁細(xì)胞:先用PBS清洗細(xì)胞1~2次,六孔板對照組和實(shí)驗(yàn)組內(nèi)各加1mlRNA裂解液或0.5ml覆蓋細(xì)胞,吹打細(xì)胞使其裂解,并將細(xì)胞+RNA提取液轉(zhuǎn)移至1.5mlEP管中(無酶),做好標(biāo)記,室溫靜置5min左右;

    2) 向上述裂解液中加入1/5RNA裂解液體積的氯仿200ul(1ml)/100ul(0.5ml),蓋緊管蓋,劇烈振蕩15s左右,使兩者充分混合,呈現(xiàn)乳濁狀(RNA裂解呈粉紅色),室溫靜置5min。
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    3)12000×g 4℃離心15min,樣品分層:上層無色液體,中間層乳白絮狀沉淀(盡量不要吸取到,可能會(huì)導(dǎo)致基因組DNA的污染),下層粉紅色有機(jī)相,小心吸取上層無色液體至新的無酶EP管中,通常情況下,取小于RNA裂解液體積的60%約為500ul/200ul。
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    4)在新的EP管中加入等體積的異丙醇,上下顛倒混勻,室溫放置10min;
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    5)2000×g 4℃離心10min,去上清,出現(xiàn)白色膠狀沉淀即RNA;

    6)現(xiàn)配現(xiàn)用75%的乙醇(15ml離心管:11.25ml無水乙醇+3.75mlDEPC水/無RNase-free水),加入1.5ml離心管中,輕輕將沉淀彈起洗滌沉淀,7500g× 4℃。一般洗兩次。

    7)室溫晾干5min左右,一般沒有被揮發(fā)的液體為無核酶水。最后加入30-50ul(一般加入30ul),溶解沉淀。放置-80保存以供后續(xù)使用。
    三、注意事項(xiàng)
    1、上述步驟為常規(guī)提取RNA的步驟,前提是我們的細(xì)胞量足夠,否則整個(gè)過程可能就非常考驗(yàn)“信念感"(很可能在異丙醇沉淀RNA這一步驟未有白色沉淀出現(xiàn)):

    (1)做過:6孔板每孔鋪100萬細(xì)胞,3孔并提最終RNA濃度可達(dá)1000多ng/ul,目前200萬每孔R(shí)NA濃度穩(wěn)定在300-500ng/ul(六孔板細(xì)胞鋪板數(shù)目有限);

    (2)步驟3)中吸取水相時(shí),盡可能大小移液槍交替使用,例如取500ul,可使用200ul、100ul、50ul等體積多次吸取,盡量不要吸取到中間的絮狀沉淀。

    2、異丙醇沉淀RNA這一步很關(guān)鍵,在我們離心后吸取丟棄上清時(shí),在這一步之前我們有必要記住離心管放置的位置,例如離心管蓋子方向統(tǒng)一朝外,根據(jù)離心方向,我們可以有選擇吸棄上清,如下圖所示。
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    圖3. 離心管擺放位置
    3、值得注意的是75%的酒精現(xiàn)配現(xiàn)用,濃度過低洗滌不佳,還會(huì)導(dǎo)致RNA溶解,事實(shí)上第二次洗滌沉淀時(shí)我們也可以使用100%酒精,離心轉(zhuǎn)速7500×g或不更換轉(zhuǎn)速12000×g也可,洗滌次數(shù)不能偷懶,洗滌不干凈可能會(huì)造成后期RNA濃度測定時(shí)蛋白質(zhì)污染。

    4、室溫晾干RNA沉淀時(shí),可以倒扣離心管在濾紙上或者放在通風(fēng)櫥內(nèi),放置時(shí)間不宜過長,時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致RNA不易溶解。

    5、最后,在異丙醇沉淀RNA這一步驟中,如果看不見沉淀或者看不清沉淀,一種方法是我們可以使用手機(jī)手電筒或者mini小手電照射離心管管壁,可能會(huì)有微小的白色附著物,或者如第3點(diǎn)中所說的記住離心管的擺放位置,大小移液槍更換小心吸棄異丙醇。之后按步驟來可能仍會(huì)提出RNA。

    6、另外,TRIZOL法提取RNA可將細(xì)胞收集至離心管中即步驟(1)完成后,可將含細(xì)胞的RNA裂解液于-80冰箱保存保存月余。

    7、通常為了節(jié)約試劑,減少用量,0.5ml的TRIZOL足夠RNA的提取。


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