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    神奇的生物素biotin

    發(fā)布時間： 2024-03-26　　點擊次數(shù)： 1386次

    1. 什么是生物素？

    物素分子量為244.31，分子中有兩個環(huán)狀結構，其中I環(huán)為咪唑酮環(huán)，是與親合素結合的主要部位；II環(huán)為噻唑環(huán)，上有一戊酸側鏈，其末端羧基是結合抗體和其他生物大分子的結構。利用生物素的羧基加以化學修飾可制成各種活性基團的衍生物，稱為活化生物素，同時可根據(jù)特殊的用途對這些試劑的化學性質（溶解性、臂長、可剪切與否）進行優(yōu)化，以適合與各種生物大分子結合的需要。

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                                                                  生物素

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    2. 什么是生物素化？

    生物素化是指將化學物質或分子與生物素（biotin）結合在一起的過程。生物素是一種水溶性的維生素，也被稱為維生素B7或維生素H，它在許多生物體的生物化學過程中發(fā)揮著重要作用。生物素可以通過化學合成或從天然來源（如食物中）獲得。生物素化通常在生物實驗室中用于標記和檢測特定的分子或蛋白質，其中生物素與待檢測的分子或蛋白質結合，然后可以通過生物素與其他分子之間的特異性相互作用來檢測或純化目標分子。


    3. 什么是生物素-鏈霉親和素（SA-Biotin）系統(tǒng)？

    Streptavidin是一種具有四個相同結合位點的蛋白質，它能夠與生物素結合形成非常緊密的復合物，也是已知的非共價相互作用之一（解離常數(shù) (Kd) 約為 10x-15 mol/L）。生物素和Streptavidin之間的鍵形成非常迅速，一旦形成，它不受pH值、溫度、有機溶劑和其他變質劑的影響。生物素與Streptavidin之間的結合非常特異，因為它們之間存在著高度親和力。這種親和力使得生物素-Streptavidin復合物成為一種非常有用的工具，用于檢測、分離和純化許多生物分子，例如蛋白質、DNA或RNA。生物素與Streptavidin互作通常被用于許多生物學實驗中的標記和純化技術，這種相互作用也被廣泛用于結合生物分子（如蛋白質、脂質和核酸）、合成分子（如熒光標記）、生物芯片技術、免疫組化、Western blot分析和其他分子生物學實驗中。

    生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的一個主要優(yōu)點是能夠提高檢測靈敏度。這在很大程度上是由于鏈霉親和素的四聚體構象。一種鏈霉親和素蛋白能夠以高親和力和選擇性結合四種生物素分子。這種多樣性能夠放大弱信號，并通過簡單的工作流程提高哺乳動物細胞或組織中中低豐度目標的檢測靈敏度。另一個關鍵優(yōu)勢是生物素-鏈霉親和素系統(tǒng)的多功能性。因為鏈霉親和素可以與多種報告標簽結合，所以它可以很容易地結合到幾乎所有的免疫測定中。例如，鏈霉親和素的酶偶聯(lián)物廣泛用于酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)，而熒光標記的鏈霉親和素，如iFluor 488鏈霉親和素，則廣泛用于細胞表面標記、熒光細胞分選 (FACS) 和其他熒光檢測成像應用。

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    鏈霉親和素-生物素標記抗體相互作用的圖示

    4. 生物素標簽的應用

    在許多蛋白質研究應用中，生物素標記（即生物素化）的蛋白質常規(guī)用Streptavidin結合物檢測或純化，包括

    1. 酶聯(lián)免疫吸附試驗 (ELISA)

    2. 免疫組織化學 (IHC)

    3. Power Styramide 信號放大，是酪胺的替代品

    4. 免疫印跡

    5. 免疫熒光顯微鏡

    6. 細胞表面標記

    7. 親和純化

    8. 熒光細胞分選 (FACS)

    9. 流式細胞術

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    Dynabeads 鏈霉親和素相關磁珠的應用

    5. 生物素標記的大致流程：

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    • 待標記物的蛋白濃度不能過低，如若濃度過低需經(jīng)超濾濃縮等手段提高濃度至0.1mg/mL以上。
    • 一個蛋白質可能被多個生物素標記，標記時，生物素與待標記物應有合適的比例，確保標記后不影響待標記物的活性。推薦生物素：抗原蛋白比例為1~3：1，生物素：抗體比例為5~20：1或根據(jù)標記試劑盒說明書推薦比例。
    • 為減少空間位阻影響，基于檢測靈敏度特異性等要求，可在生物素與被標記物之間加入交聯(lián)臂結構。
    • 如果偶聯(lián)基團為氨基，待標記物的系統(tǒng)不得含有游離的氨基（Tris,氨基酸）、載體蛋白（BSA）或者其他干擾物，若有干擾物需要用標記緩沖液反復超濾確保其去除干凈，若采用其他基團偶聯(lián)試劑，待標記物系統(tǒng)亦不能有含對應的游離基團的物質。
    • 如果待標記物為分子量較小的物質，在純化過程中注意超濾管、脫鹽柱、透析袋的截留分子量。
    • 標記反應后的體積量至少在100μL以上，以達到純化時的最小上樣量。
    • 標記反應完成后（氨基偶聯(lián)體系），可在體系中加入適量的含游離含氨基小分子物質，中和游離的生物素活化試劑，提高純化效率，減少后續(xù)反應的假陽性和高背景。
    • 純化后的標記蛋白可采用A280或BCA法測定蛋白含量。
    • 標記純化后的蛋白可根據(jù)蛋白性質進行分裝長期保存，減少凍融次數(shù)。
    蛋白互作中利用臨近連接法用生物素標記互作蛋白
    可通過生物素連接酶(Biotin-protein ligase, BirA)對Avi標簽融合蛋白或多肽快捷、高效地進行生物素標記。生物素標記的蛋白可使用基于Streptavidin或Avidin方法進行純化或檢測，例如使用Streptavidin磁珠對生物素標記蛋白進行純化，或用HRP等標記的Streptavidin對生物素標記蛋白進行檢測。Avi標簽是由15個氨基酸(GLNDIFEAQKIEWHE)組成的短肽標簽，在ATP和生物素存在的條件下，BirA在Avi標簽的賴氨酸殘基上連接一個生物素，從而實現(xiàn)目的蛋白的生物素標記。
    生物素連接酶BirA特異性的生物素標記Avi標簽有多方面的優(yōu)點。Avi標簽小且對融合蛋白的影響非常小，只針對Avi標簽上的Lys殘基進行特定位置的生物素標記，生物素標記效率高，可重復性好；體內或體外均可進行標記，標記后的蛋白與鏈霉親和素(Streptavidin)的親和力高，從而使Avi-tag技術可以應用于目的蛋白的固定吸附、純化和檢測等；相比于傳統(tǒng)生物素化學標記的非特異性位點的標記，BirA催化的反應條件更溫和、更簡單，對被標記蛋白活力影響小，酶活效率高，標記特異性強。

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    6. 生物素化核苷酸及oligo

    生物素修飾的三磷酸核苷類似物，如 dUTP 和 dCTP，可以通過酶促整合到 DNA 或 RNA 片段中，用于熒光原位雜交 (FISH)、DNA 陣列、微陣列和其他雜交技術。標準酶促非放射性DNA標記反應，包括3'末端標記、cDNA 標記、切口平移、PCR和隨機引物標記。每個生物素化核苷酸在生物素與其在核苷酸上的連接點之間包含一個 11、14、16 或 20 個原子的間隔區(qū)。例如常見的Biotin-dATP或Biotin-dCTP被用于HiC實驗添加到酶切口處；生物素標記的linker(21bp dsDNA)可用于ChIAPET實驗中連接兩個染色質DNA片段；在RNA pull down實驗中用生物素標記RNA（SP6或T7體外轉錄過程中，以Biotin-16-UTP部分取代UTP，從而轉錄生成生物素標記的RNA探針或mRNA。由于使用的RNA Polymerase對天然核苷酸(NTP)和生物素標記核苷酸(Biotin-NTP)沒有選擇傾向性，因此每個RNA轉錄產物生物素標記的程度可以通過調節(jié)轉錄反應中NTP與Biotin-NTP的比例來控制。一些試劑盒將Biotin-16-UTP的比例控制在約35%，使反應和標記效率之間達到較好的平衡。得到的生物素標記的RNA探針或mRNA可使用熒光基團、酶或抗體偶聯(lián)的鏈霉親和素(Streptavidin)進行檢測，應用與RNA pulldown或其他富集實驗。）逆轉錄反應中使用生物素修飾的引物合成帶有生物素標記的cDNA；此外，RNA-seq文庫構建中，生物素標記的Oligo(dT)與mRNA3''端的poly A退火形成雜交體，然后用帶有鏈霉親和素的順磁磁珠洗滌并捕獲雜交體，形成雜交體－磁珠復合體，最后用磁架將此復合體捕獲；

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    7. 生物素化抗體

    在做western blot或免疫組化時常使用一抗二抗來放大、顯示抗原，用酶或熒光標記二抗。生物素化的抗體，是在抗體上連接生物素（biotin），生物素能和親和素（avitin）特異性高親和性結合，親和力是抗原抗體結合的一萬倍，而且一個avidin可以結合四個biotin，這樣又起到級聯(lián)放大的作用。所以能更加靈敏的顯示微量抗原，這種方法也稱親和免疫組化。目前抗體蛋白標記技術已被廣泛用于醫(yī)學病理學、免疫組織化學、分子生物學、生物制藥等領域的分析研究與技術測定，常見的抗體標記技術包括生物素化標記法，酶標記法，熒光素標記法和膠體金標記法。生物素化抗體標記的樣品可應用酶標或熒光染料標記的親和素或生物素-親和素復合物來檢測。生物素-SP是其6原子間隔位于生物素和其共軛的蛋白質之間。當生物素-SP結合抗體用于酶免疫測定時，與沒有間隔的生物素結合抗體相比，靈敏度會提高。當生物素-SP共軛抗體與堿性磷酸酶共軛鏈維定一起使用時，這一點尤為明顯。顯然，長間隔將生物素部分從抗體表面延伸出去，使其更容易接觸到鏈霉親和素的結合位點。

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                                     生物素-SP分子。分子量454.54 Da。左22.4 ?。

    圖2. 標記鏈酶親和素生物素法（LSAB）。A. 一抗體檢測靶抗原。B. 生物素化二抗可識別一抗。C. HRP偶連鏈酶親和素與生物素化的二抗體結合，與HRP偶聯(lián)的二抗相比，能夠顯著增強信號。

    8. 如何從鏈霉親和素磁珠上解離生物素化分子?

    鏈霉親和素-生物素相互作用是已知的蛋白與其他分子間非共價的生物相互作用。生物素與鏈霉親和素間的鍵形成非常迅速，一旦形成，就不會受到pH、溫度、有機溶劑和其他變性劑等多種因素的影響。從鏈霉親和素上分離生物素時，如果實驗中使用的是生物素的衍生物或經(jīng)修飾的鏈霉親和素，那么需要特定形式和通常溫和的方法解離，除此之外通常情況下都需要非常劇烈的方法解離，并且會使鏈霉親和素變性。下面探討了其中兩種方法。

    生物素化核酸：為了從Dynabeads鏈霉親和素磁珠上分離生物素化核酸，在pH 8.2的95%甲酰胺+10 mM EDTA中孵育磁珠，65°C孵育5分鐘或90°C孵育2分鐘。使用磁力架將磁珠吸到試管壁上，將含有生物素化核酸的上清液從試管中取出。有研究提到，在高溫(120C，15分鐘)下，才能在鹽溶液中解離。另外，在6 mol/L鹽酸胍溶液(pH 1.5)中也可解離；有研究指出，生物素標記的核酸探針不能用酚抽提，否則生物素核酸會進入酚層而損失；Holmberg等（Electrophoresis 26, 501-510, 2005）報道稱，在用離子水短時間孵育后，可將生物素化DNA從鏈霉親合素磁珠上釋放（未進行測試）。

    生物素化蛋白質：對于生物素化蛋白質，則可在0.1% SDS或SDS-PAGE緩沖液中煮沸磁珠3分鐘。

    9. 鏈霉親和素磁珠結合片段的長度和結合能力為多少?

    由于具有空間位阻，因此結合能力取決于片段大小。例如，500 bp片段在Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠上的結合量是1,000 bp片段的2倍。長DNA片段會占據(jù)磁珠周圍更多空間，使其更難“找到"磁珠上的鏈霉親和素。較短的片段更易接近鏈霉親和素。對于大于2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒。該試劑盒包括Dynabeads M-280鏈霉親和素磁珠和一種可增強長生物素化DNA片段（大于2kb）固定的結合液。對于大于1-2kb的DNA片段，推薦使用Dynabeads kilobaseBINDER™試劑盒，因為結合液可增強結合能力。該結合液可使DNA線性化，進而伸展且堿基堆疊成剛性結構（不適用于質?；颦h(huán)狀核酸等較短的片段）。

    鹽濃度可影響生物素化核酸與Dynabeads鏈霉親和素磁珠的結合效率。對于1kb以內的生物素化DNA片段，最佳結合條件為1M NaCl（終濃度），25℃孵育15分鐘；較長的DNA片段應固定過夜。生物素化抗體應在含0.1% BSA，pH 7.4的PBS緩沖液中固定。由于游離生物素與Dynabeads鏈霉親和素磁珠結合的速度比大分子更快，因此應確保樣本不含過量的游離生物素。應使用HPLC或FPLC回收生物素化寡核苷酸，以避免樣本中游離生物素的存在。由于待固定的特定分子的大小和生物素化過程都將影響磁珠的結合能力，因此，可采用滴定法優(yōu)化每個單獨應用中的磁珠使用量。

    10. Dynabeads鏈酶親和素磁珠是無RNase的嗎?

    Dynabeads鏈霉親和素磁珠不是以無RNase溶液的形式提供的。處理RNA時，應使用DEPC處理的0.1M NaOH/0.05 M NaCl溶液清洗磁珠2次，每次1-3分鐘。DEPC毒性很強。但能去除RNase。清洗后，可使用DEPC處理的0.1 MNaCl溶液重懸磁珠。"DEPC處理"是指：加入0.1% DEPC，混合，室溫下解育1小時。隨后，將DEPC處理的溶液進行高壓滅菌，以破壞DEPC。

    11. 如何去除雙鏈DNA中的非生物素化鏈？

    可通過堿處理或高溫處理分離DNA雙鏈。采取堿處理時，可使用0.1 M NaOH洗脫非生物素化鏈。通常情況下，該處理方法不會對磁珠產生任何影響。在NaOH處理前，在2X結合和洗滌緩沖液（10 mM Tris-HCl，pH 7.5，1 mM EDTA，2 M NaCl）中清洗Dynabeads/DNA復合物1次，除去上清液。高鹽濃度將有助于減少電荷，從而使非特異性結合最小化。向Dynabeads/DNA復合物中加入新鮮配制（很重要）的0.1 M NaOH溶液，室溫下旋轉孵育2-3分鐘（最多5分鐘）。除去含有非生物素化鏈的上清液。再用0.1 M NaOH溶液清洗Dynabeads/DNA復合物1次，除去上清液。第一次洗脫時，即可洗脫下大部分DNA。除了堿處理，也可進行加熱處理，在水中95°C加熱5分鐘即可。為防止再退火，堿處理或高溫處理后必須快速從磁珠上分離DNA，最好在冰上操作。加熱會在一定程度（在水中約為7%）上引起生物素化DNA從鏈霉親和素上解離。因此，通常更推薦采用堿處理法。

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